진핵 생물 유전체 연구의 선구자

한 여름 내리 쬐는 햇볕 아래서 일한 후나 운동 등으로 땀으로 범벅이 된 몸을 샤워한 후 시원한 맥주 한 잔. 누구나 한 번쯤 해본 상상일 것이다. 맥주 회사들의 광고 역시 그런 점을 노려 광천수로 만든 깨끗한 맥주, 시원한 맥주를 표방한다. 이런 맥주는 고대 이집트 시대부터 마셔온 음료수라고들 한다. 그러나 이런 맥주도 효모균이 없었다면 아마 만들 수 없었을 것이다. 어디 맥주뿐이겠는가. 우리가 간편히 밥 대신 먹게 되는 빵 역시도 효모에 의해 만들 수 있는 대표적인 음식이다. 그러나 이런 발효 과정이 효모의 작용에 의한 것임을 알기 시작한 것은 불과 170여 년 전이다. 또한 최초로 효모가 관찰된 것은 이보다 훨씬 오래 전인 1680년 뤼벤후크(van Leeuvenhoek)에 의해서였다.

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그는 직접 만든 현미경으로 여러 가지 미생물을 관찰하던 중에 맥주 속에 많은 구형의 물체를 관찰하고 그림으로 기록하였다. 이 최초의 발견은 그 중요성이 평가받지 못하고 잊혀져 있었지만, 오늘날에는 60여 genera, 500여 종(species)의 효모가 분리되었다. 그 중에서도 가장 활발한 연구가 진행된 효모 연구는 오늘날 Saccharomyces cerevisiae로 분류되는 맥주 또는 포도주 발효 효모이다. 이제부터 S. cerevisiae의 특성과 유전체 연구에 대한 내용에 대해 알아보고자 한다.

효모는 진핵미생물(핵과 세포질이 핵막에 의하여 나누어져 있는 생물)에 속하며 세포벽, 세포막, 핵, 사립체, 과립 등 세포 소기관을 갖추고 있다.

성의 구별이 없는 이들은 주로 budding(출아법)으로 번식하는데, 분리된 많은 효모들 중에는 발효능이 없는 것, budding 대신 fission(분열) 혹은 bud-fission 방법으로 증식하는 것, ascospore(자낭포자)가 아닌 ballistospore를 형성하거나 spore(포자)형성이 관찰되지 않는 것 등 다양한 그룹의 효모도 존재한다

크기는 보통 5∼10×5∼12㎛로 세균의 5∼10배 크기이며, 적정 pH는 4.5∼5.5이나 1∼10에서도 생존한다. (pH1에서 12시간 생존) 효모는 박테리아보다 산에 강하므로 배지의 pH를 3.5~3.8 정도로 맞추면 박테리아의 오염을 어느 정도 억제할 수 있다.

효모의 전자 현미경 사진<web.chungnam.ac.kr/dept/micro
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효모는 균 종에 따라서 조금씩 차이가 있으나 대부분 20~25℃에서 잘 자란다. 보통은 50℃이상에서는 사멸한다고 하지만 그 온도 이상에서 합성이 되지 않는 성장요소를 배지에 직접 첨가해 줌으로서 어느 정도는 극복이 가능하다. S. cerevisiae의 경우 40℃이상에서 사멸하지만 배지에 올레익산(oleic acid)와 에르고스테롤(ergosterol)을 첨가해 줌으로서 이를 방지할 수 있다. 효모 균체 자체는 단세포 식물로서 단백질과 미량광물질을 다량 함유하고 있다.

일반적으로 효모는 다른 미생물과 같이 성장에 있어서 탄소원과 에너지원, 무기 및 유기 질소원, 각종 미네랄 및 비타민을 필요로 한다. 효모 탄소원으로는 포도당(glucose), 갈락토스(galactose), 말토스(maltose), 자당(sucrose), 락토스(lactose) 등을 사용하며 질소원으로는 다양한 종류가 알려 졌는데 보통 요소(urea), 암모늄 이온(ammonium ion), 아미노산(amino acid) 는 효모에 의해 쉽게 이용되는 질소원으로 알려져 있다. 효모가 필요로 하는 비타민 중 메소-이노시톨(meso-inositol)을 제외한 모든 비타민은 조효소(coenzyme)의 일부로서 촉매작용(catalytic function)을 수행한다.

효모 게놈 프로젝트(Yeast genome project)의 시작은 역사의 차이는 있지만 대게 1980년대 중반으로 말한다. The European Commission program의 철학은 새로운 genome center를 만들기보다는 공동의 목표를 향해 알맞은 전문가들에게 도움을 주는 것이었다. 이 프로젝트는 37개의 실험실이 참여해서 S. cerevisiae의 3번 염색체의 염기 서열을 결정하려는 유럽 연합(European Union, EU)의 노력으로부터 시작하였다. 여기서 실험실간의 협동은 염색체를 나누어서 서로 다른 부분의 염기 서열을 결정하도록 조정하면서 이루어졌는데, 아주 성공적이었다. 그래서 유럽 연합은 100개 이상의 실험실이 참여해서 효모의 전 게놈을 밝히고자 하는 야심찬 프로그램을 시작하기로 결정하였다.

그리고 이번 프로젝트에서는 영국, 미국, 캐나다 및 일본 등의 주요 연구소과도 협동을 이루었다. 여기에는 세 개의 핵심적인 서열 결정 연구소-생거 연구소, 세인트 루이스에 있는 워싱턴 대학의 게놈 시퀀싱(sequencing)연구소, 스탠포드 대학-들이 참여해서 프로젝트의 수행 속도를 빠르게 하였다. 총괄 조정자이자, 벨기에의 루베인 카톨릭 대학 (the Catholic University of Louvain)의 고포 (Andr Goffeau) 및 600명 이상의 연구자들은 효모가 16개의 염색체 안에 사람을 포함한 다른 종들과 유사성을 갖는 많은 유전자들을 가지고 있기 때문에 고무되었다. 이는 효모의 염기 서열이 진핵 생물의 진화에서부터 사람의 유전병에까지 이르는 많은 문제들에 좋은 단서가 될 것임을 의미하는 것이다.

효모의 3번 염색체의 315kb가 완전히 밝혀졌을 때는 매우 주목할 만한 과학적인 사건이었다. 왜냐면 이것은 최초로 염기서열이 밝혀진 진핵 생물의 염색체였을 뿐만 아니라 S. cerevisiae와 같은 다른 연구된 생물들로 확장해서 염색체를 이해할 수 있기 때문이다. DNA sequence로부터 예상했던 protein-coding gene의 대부분은 어떤 우연에 의한 염기 배열(sequence)은 없었다. 이것은 과학자들의 예상과 달랐기 때문에 처음에는 받아들이기 어려운 것이었다.

결국 3번 염색체의 염기배열은 완전히 정의되었고 처음보다 더욱 확장되었다. 모든 유전자가 존재하는 a free-living 진핵 세포(eukaryotic cell)이 확인되었다. 그리고 최초의 진핵 유전체의 완전한 해부(anatomy)가 확인되었다. (여기에서 우리는 효모 유전체 프로그램(yeast genome program)으로부터 무엇을 배울지 시험하게 된다)

체계적인 염기 서열 분석(systematic sequencing)이 시작되었을 때 정보의 내용과 효모 유전체(yeast genome)의 구조적인 유기조직(organization)은 어느 정도 밝혀진 상태였고 이미 이용되고 있었다. 여러 수백 개의 유전자들은 이미 결정되었고 그들 유전자의 대부분은 지도 작성(mapping)이 이루어 졌다.

intron(인트론:DNA에서 RNA로 전사될 때 발현되지 않고 제거되는 지역)은 거의 없고 짧고 반복적인 배열이 자주 나온다. [Ty(the few mobile genetic elements)를 제외하고] 그리고 처음으로 retrotransposons(역전위효소)이 발견되었다. 그 후 1994년 중반 8번, 2번, 1번, 5번, 9번 염색체가, 1995년에 6번, 13번, 10번 염색체가 완성되었고 전체의 염색체 염기 서열은 1996년 1월에 완성되었다.

모든 유전자에 관한 정보는 연구자들에게 효모의 작용에 관해 상세한 모델을 만들 수 있게 해준다. 예를 들면, 특정 생화학 경로에 있는 모든 요소들을 밝히는 등의 작업이 가능해질 것이다. 유전자 조절의 양상을 결정하는 것은 다른 또 하나의 목표이다.

또한, 연구자들은 이 서열 데이터들을 기지고 효모와 다른 종들 사이에 상세한 비교 연구를 하는 것이 가능하기 때문에 많은 진화학적인 연구들을 불러일으키기를 원한다. 하나의 목표는 이 서열로 먼 친척 효모인 Schizosaccharomyces pombe와 비교 연구하는 일이다. 이 효모는 S. cerevisiae로부터 분리된 것으로 5천년에서 1억 년의 진화를 거쳤다. 비록 게놈의 크기가 서로 비슷하지만 둘은 상당히 다른 방법으로 진화하였다. 이 효모의 나머지 염기 서열이 결정되면 모든 진핵 생물에 필수적인 유전자들의 기본 모음을 알게 될 것이다.

의학 연구자들도 새롭게 발견된 효모의 유전자들에 흥미를 갖는다. 병과 관련해 클로닝(cloning:미수정란의 핵을 체세포의 핵으로 바꿔 놓아 유전적으로 꼭 같은 생물을 얻는 기술 )된 51개의 사람 유전자 중에서 13개가 효모의 유전자들과 유사성을 보이고 12개 정도가 약하지만 연관성을 가진다. 따라서 사람에게 행하지 못하는 실험들을 효모를 대상으로 수행할 수 있는 이점이 생기는 것이다. 예를 들면 효모에서 이 유전자들을 손상시켜서 어떤 현상이 일어나는지 보면 사람에게서 기능이 무엇인지 단서를 찾을 수 있을 것이다.

The ultimate anatomy of a eukaryotic genome은 진핵생물의 염기 배열로서 이용될 수 있다. 효모 유전체는 적당한 위치에서 양쪽 모두를 가지고 있으며 적당한 위치에 존재하고 있다.(원핵과 진핵 사이)

G+C의 비율은 39%이고, 대부분의 진핵에서 전형적으로 보이는 디뉴클레오티드(dinudeotide)형태를 보인다. 그러나 5'CG3', 5'TA3' 디뉴클레오티드의 주요한 결손이 존재한다.

다세포생물(multicellular organism)을 효모 유전체와 비교해서 나타나는 뚜렷한 차이점은 compactness이다. Open reading frames(ORFs)은 ribosomal DNA를 제외한 효모 유전체에서 72%를 차지한다. noncoding DNA가 거의 없고 모두 다른 구조와 기능을 가진다.

가장 긴 ORF는 4910 codon(코돈:유전정보의 최소단위)으로 12번 염색체이고 기능은 알려지지 않았다. 그 다음의 경우 4092 코돈으로 11번 염색체이고, 1500 코돈 이상의 것은 거의 없다. 그리고 ORFs의 크기가 작아지는 경우는 크기에 제한이 존재하지 않는 것으로 보인다. 이유는 기능에 있어서 직접적인 정보의 결손이 존재하기 때문에 이를 방어하기 위해 ORFs의 크기가 작은 경우 유리하게 작용하는 것으로 보여진다. 또는 실제 short gene은 명확히 short ORFs에서 발현되는 것과 비교하기가 쉽지 않다고 한다 .

효모 유전체 프로그램에서 낮은 단계의 제한(lower limit)와 같은 경우 100 코돈을 가지고 있는 경우도 있다. 즉 PMPI의 경우 Shorter protein-coding genes이다. 이것은 40개의 아미노산으로 구성되며 원형질막(plasma membrane)의 프로테오리피드(proteolipid)로 encoding되어진다. 몇 몇 짧은 유전자들(short gene)은 인트론(intron)의 존재 하에서 동정할 수 있고, corresponding transcript(전사)의 존재 하에서도 동정할 수가 있다. 그들은 결손 되어지거나 또는 정확하게 나타나기도 하는데 이것은 실제 유전자들의 수가 극소가 되게 하는 최적조건으로 되게 하는 경향을 보인다.

ORF들의 크기 분배에 있어서 효모 유전체의 compactness는 유전자 내부 지역(intergenic region)의 짧은 크기와 인트론이 거의 없는 경우로 나타나기도 한다.

효모 유전학(yeast genetics)에서 중요하게 고려되는 것 중 하나는 splicing mechanism(전사과정에서 인트론을 제거하는 과정)의 연구이다. divergent ORFs의 평균치(average)는 단지 618 nucleotide로 이루어졌다. 그리고 convergent ORF의 경우는 328 nucleotide 부분(aparts)으로 이루어져 있다.

전형적인 효모 유전자는 309 bp의 upstream region과 163 bp의 down stream region사이에 1450 bp ORF preceded가 존재하고 전체적으로는 단지 1922 bp가 만들어진다. 그리고 효모 유전체에서 존재하는 전체 숫자의 추정치는 약 6200 ORFs(Table Ⅰ)을 예상한다. 코돈의 사용 방식(codon usage)과 다른 표준에 의하면(실제 유전자에 사용되지 않는 것의) 약 6∼7%정도로 기대한다. 그리고 실제 효모에서 전체적으로 5800개의 protein-coding gene이 있을 거라고 예상한다.

인트론의 경우 매우 작고 짧지만 (가장 긴 것이 1kb정도이고) 일반적으로 initiator ATG 코돈의 5'end에 위치하며 또는 그 사이에도 있고 때론 5' untranslated 지역에도 존재한다.

효모 유전체의 다른 유전 인자의 수를 염기 서열 분석 자료(sequence data)로부터 추론할 수 있다. 또 전체 270 tRNA gene은 3개의 인트론(intron)을 함유하고 있다고 예상된다.(8번째 minimal set)

여러 형태의 Ty인자는 상대적으로 드물게 나타난다. 즉 인트론은 tRNA gene의 Upstream integration에 중요한 선택권이 있는 것으로 보인다. 아마 RNA polymerase Ⅲ transcription machinery와 인트론 상호 작용의 결과일 것으로 보인다. (RNApol Ⅲ와 Intron의 결합) 이것이 보다 명백한 것으로 보이는 이유는 단일의 long terminal repeats (LTRs)가 매우 많은데 이것은 고대 Ty 축적(integration)으로부터의 잔여물이라고 생각된다. 그리고 이것은 항상 tRNA gene이 약 500 bp upstream안에서 발견되는 데서 추측할 수 있다.

다른 알아볼 수 있는 구조는 subtelomeric X and Y인자를 포함해서 효모 유전체의 주요한 부분이다. 부분적인 Overlapping 사이에서 frame Shift ORF fragment의 경우 몇몇 ORF는 1또는 2개의 정지 코돈(stop codon)이 되는데 이것의 대부분은 subtelomeric region에 위치한다.

유전자의 밀도(Gene density)는 염색체 지도에서 획일화되어 있지 않다. 그리고 유전자의 밀도 대부분의 염색체 지도(Chromosome map)에서 존재하는 단편(segment)이다. 또 그들은 수십 kb길이로 존재하는데 평균이상으로 주요하게 나타나기도 하고, 많은 곳에서 85%이상이 나타나기도 한다. 어떤 염색체의 염기배열은 상대적으로 유전자 밀도가 낮은 다른 지역에 의해 분리되어 진다. 몇몇 염색체에서는 유전자밀도가 낮은 곳은 규칙성(regular)이 떨어지기도 한다. Subtelomeric region과 pericentromeric region은 항상 낮은 유전자 밀도로 보인다. 대부분의 염색체에서 왓슨(Watson)과 크릭(Crick) strand의 포괄적인 코딩( overall coding)비율은 평균적으로 매우 유사하다(Ⅱ는 제외). 그리고 ORF orientation은 전체적으로 무작위적(random)으로 표현된다.

효모 염색체에서는 또한 Long-range composition의 다양성이 존재한다. 최초의 보고서는 3번 염색체이다. 이 보고서에서 각각의 팔(arm)의 중간에 주요(major) GC-rich Peak가 발견되었고, 11번 염색체에서도 이것이 발견되었다. 그러나 거대한 크기(size)때문에 한 개의 염색체 팔(arm)에서 여러 GC-rich peak가 나타날 수도 있다.)

A-T rich의 경우 pericentromeric과 subtelomeric region에서 비록 GC-rich peak 사이의 공간에서 나타나지만 항상 규칙적으로 나타나는 것은 아니다. <그림. 16개 chromosome의 centromere region>

대부분의 경우 높은 GC 함량(content)과 높은 유전자 밀도 사이의 위치(composition)관계는 보다 더 복잡한 유전자들인 경우가 많다.

전체적으로 효모 유전체에서 주목할 것은 반복 서열이 거의 없다는 것이 특징이다. 예외적으로 Ty 인자와 Solo LTRs는 rDNA의 대부분이 반복서열에 의한 것이다. rDNA 반복형태는 긴 세로의 배열로 12번 염색체의 반을 차지한다. 그리고 고정되어있지 않은(free) 구형의 형태(circular form)로 존재한다. 13번 염색체의 경우 약 15반복 서열의 덩어리(Cluster)가 존재하는데 (각 길이는 1998 bp) CUPI 유전자를 가지고 있는 것이 관찰되어진다.

이들 종(Strain)사이에 여러 형태학적인 다양성이 나타나는데, poly(A) or poly(T) and alternative poly(AT) tracts가 같은 짧은 올리고뉴클레오티드(Oligonucreotide)의 반복 배열이 존재한다.

그리고 효모는 ORFs와 유전자 내부지역(intergenic region)에 거대한 트리뉴클레오티드(trinucleotide)를 가지고 있다. 이것이 흥미 있는 것은 인간의 유전적 질병 중에 트리뉴클레오티드의 확장에 의한 것이 있기 때문이다. 트리뉴클레오티드는 인간과 효모에서 모두 완벽하며 불안전한 경우는 없다.

유전자의 기능 조직화 진화에서의 주요한 문제점은 유전 정보의 과잉이다. 기능의 과잉은 복제로부터 기원하는데 상이(divergence)나 독립적 기원의 유전자로부터 기능의 집중성(convergence)이 일어난다. 여러 지역에서 같은 유전자의 복제는 효모 유전자에서도 쉽게 발견된다.

subtelomeric regions에서는, (많은 분절된) 수십 kb의 길이와 여러 ORFs를 함유하고 있고, 유전적 정보의 변화가 일어난다. 이것은 여러 염색체에서 많이 동정되어진다. 반대로 여러 유전자가 뭉쳐져서 한 개의 정보를 함유하는 경우 서로 다른 염기 배열 순서의 결합에 의해 단일 유전자의 복제가 일어나기도 한다. 이것은 몇몇 유전체 사이에 유전자가 흩어져있거나 세로 또는 가역적으로 복제가 일어난다.

현재 DNA의 염기 서열을 규명하는 것은 기술적으로 매우 쉬운 일이다. 그러나 염기 서열만으로는 이 유전자가 어떤 기능을 하는지를 알 수 없는 경우가 많다.

미국의 생명공학회사인 큐러젠(CuraGen)과 워싱턴대학 연구팀은 영국의 과학전문지 네이처에 발표한 연구보고서에서 효모의 모든 단백질이 어떻게 효모를 형성하고 지탱하는지를 보여주는 최초의 지도를 완성했다고 밝혔다.

큐러젠의 리처드 리프튼 박사는 이는 '기능 유전체학(functional genomics) 분야에서 이루어진 획기적인 업적' 이라고 평가하고 효모의 전체적인 유기체안에서 이루어지는 단백질들의 상호작용이 완전 해독됨으로써 인간을 포함한

효모가 출아하는 모습
<www.mips.biochem.mpg.de/proj/yeast/info/intro.html>

모든 생명체가 공유하고 있는 생화학 기능을 이해할 수 있게 될 것이라고 말했다.

기능 유전체 분석(functional genetic analysis)의 새로운 점은 유전자나 단백질을 서열의 유사성에 의해서 분류하는 것이 아니라, 기능에 의해서 분류한다는 것이다. 생물학적으로 말하면 이 방법이 더욱 현실적이다. 생존이나 번식에 필요한 생화학적 경로(에너지의 생성, 필수 물질의 합성)에는 서로 상호작용을 하는 단백질들의 세트가 필요하다. 이러한 세트의 단백질들은 유전자의 DNA 염기 서열로 서로 관련이 없는 경우가 있으며, 이런 경우에는 서열의 유사성으로 기능을 규명할 수가 없다.

16개의 염색체에 총 6천 개의 유전자가 배열되어 있는 효모는 인간의 질병을 연구하는데 모델로 이용되고 있는 유기체로 인간과 공통된 유전자들을 많이 가지고 있다. 특히 인간의 대사장애, 암, 자가면역질환, 신경질환과 관련된 유전자는 효모의 유전자와 매우 흡사하다. 따라서 효모가 만드는 단백질의 기능을 이해하면 인간 유전자가 만드는 단백질이 어떤 기능을 하는지를 보다 확실히 알 수 있으며 이를 통해 복잡한 질환과 특정 유전자간의 연관성에 관한 중요한 정보를 얻을 수 있을 것으로 믿고 있다.